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BrdU是一种合成的胸苷溴化类似物，英文全称5-bromo-2'-deoxyuridine，中文全称5-溴-2'-脱氧尿苷，在S期可替代胸苷选择性插入细胞DNA。BrdU通常广泛用于测定DNA合成和标记分裂细胞，用来研究诱导细胞增殖的信号通路和其他生理过程。BrdU通过体外细胞培养或体内注射的方式进行探针加载，然后用抗BrdU的抗体进行特异性检测。

BrdU标记后，对组织或细胞进行固定和透化后，需要额外的DNA水解步骤(有时也称DNA变性)，从而允许抗BrdU的抗体能够与插入DNA的BrdU结合。BrdU抗体能够与其他细胞标记物如Ki67，双皮质素(DCX)和NeuN联合使用来鉴定增殖细胞和新分化神经元。

• BrdU是一种诱变剂，操作过程一定要注意防护，不要与皮肤直接接触。另戴口罩避免粉尘吸入。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 体外标记细胞
  
  • 制备BrdU储存液(10mM)：称取3mg BrdU(分子量307.10)溶于1mL去离子水，充分溶解即可。
    
  • 用细胞培养基按照1∶1000的比例将储存液稀释成10μM的BrdU染色液，并在无菌条件下用0.2μm滤膜对染色液进行过滤除菌。
    
  • 吸掉细胞内培养基并更换无菌的10μM BrdU染色液，置于CO₂培养箱37℃孵育1～24h。
    
    • BrdU孵育时间取决于细胞分裂速度。原代细胞可能要高达24h，但快速增值细胞系可能仅需1h。达到最佳信噪比的时间需要通过优化条件来确定。
  • 吸掉细胞内染色液，用PBS清洗2次，每次至少5 s。
    
  • 根据标准免疫细胞化学(ICC)操作流程进行细胞固定和透化。但是在开始免疫染色前需参照下述的DNA水解步骤。
• BrdU体内标记(本制品未经动物注射实验检测)
  
  • BrdU体内标记方法比较多，常见的有腹腔注射法(Intraperitoneal injection)和口服法。以下为腹腔注射法的步骤，其他方法可参考文献或根据实验室固有经验操作。
  • 用1×PBS溶解适量的BrdU配制成10mg/mL储存液，过滤除菌，按照单次用量分装冻存后待用，避免反复冻融。
    
  • 对于小鼠，通用情况注射浓度为100mg/kg。
    
  • BrdU标记完成后，根据实验室已成的步骤处理动物。
    
    • BrdU插入快速分化组织比如小肠，在注射后30min就能检测到。但大多数组织可能需要高达24h才能检测到。合适的处理时间和注射剂量
      
    • 需要根据组织类型来优化。
• DNA水解(DNA变性步骤)
  
  • 细胞样本：
    
    • 用1～2.5M HCl室温孵育细胞10min～1h，实际的HCl浓度和孵育时间根据实验来优化。如果使用更短的孵育时间，37℃孵育可能比室温孵育效果更好。
      
    • 可选步骤：去除HCl，用0.1M硼酸钠缓冲液，pH8.5室温中和30min。
      
      • 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)配制方法：称取3.8g硼酸钠(分子量381.4)加入100mL蒸馏水，充分溶解后，用NaOH调整到所需pH。
    • 用PBS清洗3次，每次不少于5 s。
      
    • 根据标准ICC操作流程继续后续染色。
  • 组织切片：
    
    • 对于石蜡切片必须先做脱蜡处理再进行DNA水解步骤。
    • 用1～2M HCl室温孵育切片30min～1h，实际的HCl浓度和孵育时间根据实验来优化。如果使用更短的孵育时间，37℃孵育可能比室温孵育效果更好。
      
    • 可选步骤：去除HCl，用0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)室温中和切片10min。
      
      • 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)配制方法：称取3.8g硼酸钠(分子量381.4)加入100mL蒸馏水，充分溶解后，用NaOH调整到所需pH。
    • 用PBS清洗3次，每次不少于5s。
      
    • 根据标准IHC操作流程继续免疫染色步骤。